醫用硅橡膠的抗菌

由于具有一些固有特性，例如與人體組織的生物相容性，硅橡膠通常被用于醫療設備。雖然硅橡膠本身相對呈惰性，但在使用設備期間，有機營養物可能吸附到硅橡膠表面，并形成生物膜。許多含有硅橡膠的設備暴露于適合生物膜生長的恰當濕氣、營養物、時間和溫度條件，包括移植、導管、靜脈注射連接器以及用于呼吸治療的管道。隨著接觸時間的增加以及沒有成功進行干預，產生微生物的生物膜會造成感染。 用于硅橡膠的抗菌劑 將抗菌劑集成于醫療設備內部或表面是一種降低微生物聚積在醫療設備表面并形成生物膜的可行戰略。經過抗菌劑處理的醫療設備多種多樣，包括導管、魯爾設備、氣管導管以及傷口敷料。少數情況下，使用抗菌劑設備不僅已經顯示可以殺滅設備表面的微生物，而且還可降低感染率。 銀基硅橡膠抗菌劑 抗菌劑處理的生物相容性是需要考慮的重要問題之一。細胞毒性是敏感的生物相容性試驗；經過處理的設備或設備濃縮劑直接暴露于哺乳動物細胞培養的細菌。銀基抗菌劑會在這些體外試驗中引起一些細胞毒性效應，但是，在嚴格的研究和對組織、整個動物和人體開展的觀察中，則展現出很少的生物相容性問題或者沒有生物相容性問題。在提交醫療設備進行的評審中，美國食品和藥品管理局（FDA）和其它管理機構檢查整套數據，以確定設備是否生物相容。由于銀基抗菌劑用于傷口處理和其它應用的歷史較長，管理機構和保健提供商對銀具有一定的熟悉程度，而這種熟悉程度對于其它抗菌劑可能是沒有的。為此，銀是目前為止用于抗菌醫療設備的常見抗菌劑。 在集成于聚合物、樹脂或涂層之后，存在已經加工銀釋放銀離子的幾種不同配方。不管銀技術是否基于銀金屬(AG0)、銀鹽（例如AgCl）或離子銀（Ag+）或者銀離子的其它多價產品，產品必須終釋放離子銀以成為一種有效的抗菌劑。銀金屬(Ag0)沒有抗菌活動，必須進行氧化，以形成終可以釋放離子銀的產品。這一系列研究中描述的銀基技術是一種稱為SelectSilverSR12(SSSR12)的配方，將銀離子(Ag+)包在微微溶解的玻璃微粒內。SSSR12抗菌劑通過溶解機制從基于玻璃的無機矩陣緩慢釋放銀離子。當周圍環境（體液、靜脈注射液等）接觸微粒時，矩陣緩慢溶解，從而釋放銀離子。表面釋放銀離子的速度緩慢，但是足以快到在基底上面和附近維持有效的濃度。 在銀離子離開經過SSSR12處理的材料表面時，會由于與相鄰水成環境中存在的蛋白質、鹽或其它基底發生非特定交互作用而不活躍（圖2）。這類交互作用以各種形式的銀離子釋放技術出現。當未粘附的銀離子到達微生物表面時，抗菌的作用機制開始。微生物細胞攝取銀離子的機制有幾種，包括將銀離子擴散到細胞內以及使用通常傳輸基本離子的系統進行主動傳輸。雖然Ag+會采用非特定的方式粘附到細胞表面并造成細胞膜功能中斷，但是，人們廣泛認為，Ag+的抗菌特性依賴于與細胞內的現場交互作用。進入細胞之后，銀離子開始中斷微生物的重要功能。銀離子的反應性高，隨時準備粘附到含有硫、氧和氮的給電子體官能團上以及磷酸鹽和氯化物等負電荷官能團上。銀離子的主要分子目標駐留于細胞硫醇(-SH)官能團內，通常發現位于稱為酶的重要蛋白質中。酶會變性，因為存在由于Ag+粘附而造成的構象變化。生成細胞能源時需要Ag+變性的許多酶。如果充分中斷微生物細胞生成能源的能力，則微生物將快速死亡。 硅橡膠中抗菌劑的評估 如果生物相容性試驗的結果表明抗菌劑處理對于其用途安全，則其它關鍵方面是處理的有效性。基于銀的處理的抗菌效力評估遵循始于確定經過處理的材料內部或上面的劑量的試驗計劃。對于熱塑性塑料，用于確定銀劑量的方法涉及將樣品加熱到高溫度，以揮發和燒毀所有有機材料，然后用酸溶解灰燼，以溶解和釋放銀離子。確定溶解溶液中銀離子濃度的常用方法是原子吸收光譜(AAS)或電感耦合等離子體發射光譜(ICP-OES)。但是，眾所周知，很難采用化學方法溶解硅橡膠。確定經過處理的硅橡膠中銀含量的另一種方法是采用X射線熒光光譜法(XRF)。這種方法利用了銀的X光信號的優點。該方法生成“X射線量”方面的結果，只提供相對的銀劑量。量化銀的數量要求建立已知銀濃度對比X射線量的一根標準曲線。知道已經達到材料中銀抗菌劑的目標劑量之后，需要了解銀釋放的動力。必須從表面釋放銀且能夠進入微生物的細胞，以達到大效力。常見的方式是，釋放銀的形式是銀離子Ag+。一般來說，將經過處理的材料暴露于模仿終應用的溶液。然后使用AAS或ICPOES測量洗提液中的銀離子濃度。通常修改暴露場景，以符合預期體積與表面面積的比率以及成品醫療設備的暴露持續時間。例如，基于硅橡膠的導尿管會每天暴露于人工尿或鹽水新鮮溶液，時間長達連續30天。這些試驗可以幫助了解銀基抗菌劑技術是否相容硅橡膠矩陣，是否有能力持續受控地釋放銀離子，以及硅橡膠是否加載足量的抗菌劑，以釋放銀離子達到預期的使用持續時間。 后篩查經過處理的材料抵抗微生物的效力。通常分級開展抗菌劑的效力試驗。首先，將經過處理和未經處理的硅橡膠樣品暴露于微生物24小時，并確定存活微生物細胞的降低量。如果初篩查試驗顯示積結果，則修改效力試驗參數以更好模擬設備的預期使用條件以及相關目標微生物。在確定銀釋放動力時，效力方法涉及修改接觸經過處理的材料的溶液、體積與表面面積比率以及接觸的持續時間。在本文總述的研究中，檢查了基于銀的幾個不同抗菌劑，以確定其用于醫療設備的LSR的處理性能。 實驗 采用各種方法制備LSR樣品，包括混合抗菌劑與LSR元件或者通過三種流量擴散添加抗菌劑。采用壓縮或注射模注樣品塊或實際設備元件。 硅橡膠中銀基抗菌劑劑量的確定 使用X射線熒光光譜（XRF；ThermoNoranQuanXEC公司，型號：C10014）確定樣品中不同元素的含量估計值。XRF分析產生以“單位”為術語的元素濃度；單位越高，元素的濃度越高。但是，單位依賴于樣品幾何形狀的程度大，因此很難比較不同幾何形狀或配置的樣品的單位。在繪制圖形和分析之前，要減除背景單位。 銀釋放動力 在室溫中將經過處理的樣品暴露于鹽水（0.85%NaCl）24小時并緩慢攪拌，以測量樣品釋放的生物藥效利用銀。使用5%的硝酸將提取物酸化并使用ICP-OES（PerkinElmer，型號：Optima4300DV）測量銀的含量(ppb)。要清除雜質，在酸化和分析之前，使用0.2微米的過濾器過濾所有樣品。 使用薄膜接觸篩查法確定效力 使用“薄膜接觸法”評估抵抗細菌的效力，這是“ISO22916：塑料-塑料表面抗菌劑活動測量”的一種修改方法。將樣品塊置于經過消毒的培養皿內并用異丙醇擦拭，以便進行清潔。然后將樣品暴露于懸浮在采用0.2%營養肉湯補充的0.85%NaCl（鹽水）中的細菌（0.4毫升，每毫升105個細胞）。采用聚乙烯薄膜蓋住細菌懸浮液，以將接種體擴散到樣品表面并防止干燥。在37℃孵化24小時之后，用10毫升中和溶液清洗樣品，以清除粘附的細胞和非活性殘留銀離子。使用基于微濃度測定板的“可能數量”化驗量化中和溶液中存活細胞的數量。將每個樣品的細胞數量轉換為對數單位后，基于從未經過處理的聚丙烯回收的細胞數量計算暴露于LSR之后細胞的對數降低數量（對數降低數量=對數（細胞/聚丙烯樣品）-對數（細胞/LSR樣品）。未經處理的聚丙烯用作內部對照樣品，因為以前的許多試驗已經表明這種材料在引起細胞數量增加或減少方面呈惰性。大對數降低數量代表效力高，可以采用特別的研究測量。使用克雷白氏肺炎桿菌ATCC（美國模式培養物集存庫）#4352和金黃色葡萄球菌ATCC（美模式培養物集存庫）#6538試驗復制樣品。 使用TTC瓊脂化驗確定效力 使用上面所述的薄膜接觸法評估抗菌的效力。將帶有微生物的樣品在37℃孵化22小時之后，從樣品上取下接種體，將樣品倒置放在采用0.01%三苯基氯化四氮唑(TTC)補充的胰蛋白大豆瓊脂板上。TTC是一種無色化合物，采用主動呼吸細菌會還原為不能溶解的紅色。將TTC集成于營養瓊脂板內，然后將暴露于微生物的樣品置于板的表面，可以根據瓊脂表面存在的紅色檢測任何存活的細菌。孵化瓊脂板24小時并觀察粘附在材料表面的存活細胞形成的紅色區域。 使用“頂部接觸”化驗確定效力 使用簡單的化驗評估帶有和不帶SSSR12的體外設備的LSR元件的效力。分散103、104或105抵抗甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC（美國模式培養物集存庫）#43300(MRSA)或克雷白氏肺炎桿菌ATCC（美國模式培養物集存庫）#4352細胞之后，立即將元件尖部接觸營養瓊脂板的表面，以接種樣品。然后將接種的樣品置于消毒盤內，并將在潮濕條件下在30℃孵化24小時。孵化之后，使元件重復接觸消毒營養瓊脂板的表面（10次）。另外在37℃再孵化營養瓊脂板24小時。如果存活細胞在暴露于LSR元件初24小時暴露時期時存活并轉移到瓊脂表面，則細胞可以在瓊脂表面的接觸部位生長和形成群體。采用導致成功轉移存活細胞的接觸數量以及觀察每一接觸點的生長量表示結果。 通過模注制備LSR樣品塊，以制備三種不同含量的SSSR12抗菌劑劑量。開展X射線熒光光譜試驗，以確定水平樣品塊中銀的含量。雖然這一特別研究中只有三個數據點，但是，在銀含量和目標劑量之間存在密切的關系(R2=0.994)（圖3）。另外還在壓縮模注樣品塊上開展了這一研究，結果相似（未顯示數據）。如果抗菌劑或抗菌劑載體含有相當獨特的信號元素，還采用XRF檢測其它抗菌劑。同時，XRF技術是一種無損技術，可以用于制造或品質保證實驗室環境的在線測量。 12小時的時間使銀離子達到平衡水平（本研究中為ca.500ppb）。緩慢釋放銀離子是通過多日使用保護表面所需要的釋放動力的一部分。另外，銀離子達到有效水平的時間框架符合形成生物膜需要的時間。 采用兩種不同劑量SSSR12處理的LSR通過重復暴露于鹽水展示出緩釋銀離子（圖5）。在單次暴露于鹽水24小時之后，劑量反應較為明顯。但是，在暴露于鹽水兩天之后，從兩種樣品中釋放的離子似乎達到大約400ppb的平衡。至少連續七天暴露于新鮮鹽水，釋放的銀維持在ca.400-450ppb。 在我們的實驗室中已經觀察到這種平衡現象多次，是由與相同溶液中存在的Ag、Cl和Na相關的共同離子效應造成的。這種平衡有效抑制了銀的釋放，直至銀離子被清除（例如沖洗清除）或者粘附到細菌或其它有機物上面。解除平衡壓力之后，再次釋放銀離子。并非所有銀基抗菌劑都能展現采用SSSR12觀察到的銀釋放動力。另一種銀基技術已經用于LSR。將模注樣品塊暴露于鹽水并采用前面所述的相同類型化驗測量銀的釋放。結果表明初釋放的速率相對較高，之后在暴露于鹽水兩天之后急劇下降（圖6）。暴露三天之后的釋放速率變得穩定，但是釋放的銀離子濃度低（<30ppb）。進一步分析表明，LSR表面的大多數銀微粒被一薄層硅橡膠蓋住，降低了濕氣到達銀微粒的能力，因此釋放銀離子的濃度降低。使用相同方法評估的其它銀基技術研究結果表明，大多數存在相同的問題。 在暴露于革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌的代表種類24小時之后，評估了采用不同劑量的SSSR12處理的LSR的噴射模注樣品塊的抗菌性能。在暴露于鹽水之前以及暴露于鹽水3天和7天之后，試驗了經過處理的LSR樣品。本研究中，作為一種樣品試驗了未經處理的LSR。將在37℃暴露于未經處理的聚丙烯樣品塊24小時之后恢復的存活細胞數量與從未經處理和經過處理的LSR產品恢復的細胞數量進行比較。與未經處理的聚丙烯相比，暴露于未經處理的LSR的兩種種類的數量微微降低（ca.0.6對數單位)。對于革蘭氏陰性細菌克雷白氏肺炎桿菌，采用SSSR12處理的LSR的所有樣品展示出大的對數降低（經過處理的產品上沒有恢復的存活細胞）。對于金黃色葡萄球菌，觀察到明顯的劑量反應，SR12的含量越高，則對數降低越高。觀察了以前沒有暴露于鹽水的樣品以及以前暴露于鹽水3天和7天的樣品的劑量反應。對于以前暴露于鹽水的樣品，在給定SSSR12劑量之內，效力保持恒定或微微增加。 采用SSSR12處理的LSR展現了在重復暴露于鹽水時抵抗兩種微生物的持續效力，與動力研究中所看到的銀緩釋相符。雖然本研究中沒有討論這一主題，但是應注意到，銀抵抗細菌比抵抗真菌更有效。同樣，銀離子很難滲透人體細胞的細胞壁和多細胞膜，銀離子不能很好滲入真菌等更復雜微生物的細胞之內。可以使用足夠的銀處理醫療設備，以展示抵抗白假絲酵母菌等真菌的效力，但是，要求的劑量高于控制細菌生長的劑量。在后期固化采用5%和10%SSSR12抗菌劑處理的LSR之前和之后，對噴射模注樣品塊開展了相似研究。表明，與未經處理的聚丙烯相比，未經處理的LSR展示出微小但是一致的效力。在暴露于鹽水之前以及暴露于鹽水7天之后試驗時，經過處理的LSR樣品展示出抵抗兩種試驗微生物的效力更高。所有樣品的對數降低量處于或接近大值。在5%的劑量暴露于鹽水7天之后，效力微微下降。后期固化對于抗菌性能沒有可以測量的影響。需要開展可以確定暴露于經過處理的表面之后存活細胞的實際降低數量的化驗，以量化抗菌效力。要求提供此類數據，以在美國和歐洲注冊經過抗菌處理的醫療設備。但是，還有其它技術可以用于快速篩查許多樣品以及提供可視的效力顯示。使用了微生物學中用于檢測主動呼吸細胞的一種常見染料（TTC）修改上面所述用于測量存活細胞對數降低的薄膜接觸法。將未經處理的聚丙烯樣品、未經處理的LSR樣品以及采用1.5%和5%SSSR12抗菌劑處理的LSR樣品在37℃暴露于克雷白氏肺炎桿菌細胞中24小時。暴露之后，將樣品置于TTC瓊脂板的表面。在37℃孵化另外24小時之后，由于瓊脂板表面生長細菌而形成紅色，因此可以觀察到存活細胞（圖7）。保留在未經處理的聚丙烯和LSR上的存活細胞展示出在TTC瓊脂板上廣泛生長。對比之下，在采用1.5%SSSR12處理的樣品上只檢測到少量存活細胞。在采用5%SR12處理的樣品上沒有檢測到存活細胞。 可以提供有意義數據的另一種化驗結果以及效力的可視圖形參見圖8。采用10%SSSR12處理的LSR被模注進體外設備的硅樹脂元件中。元件太小，不能開展前面所述的標準薄膜接觸法試驗，因此開發了一種新的方法。該方法測量接種元件可以將存活細胞傳輸到營養瓊脂板上多少次（共10次）。在接種體水平（103細胞）較低時，在MRSA的存活細胞未傳輸到瓊脂之前，未經處理的元件樣品在十次中有七次接觸瓊脂表面。在接種體水平（104-105細胞）較高時，細胞至少通過10連續接觸傳輸到瓊脂表面。對于經過處理的LSR元件，成功傳輸到瓊脂表面的次數更低。每次接觸傳輸到瓊脂板的細胞數量也似乎更少。這些數據表明，經過處理的元件表面的存活細胞比未經處理的元件表面的存活細胞少。在其它研究中觀察到，抵抗克雷白氏肺炎桿菌的效力高于抵抗金黃色葡萄球菌的效力（附表）。另一種基于銀的產品也展現出在抵抗克雷白氏肺炎桿菌方面效力好，但是，在抵抗金黃色葡萄球菌的效力方面沒有采用SSSR12處理的樣品樣品有效。接種體水平也影響經過處理的LSR的效力，因為在較低接種體水平時，出現的細菌轉移更少。另外，還在以前暴露于鹽水三天和七天的LSR元件上開展了這種化驗。如前所述，采用SR12處理的LSR的效力似乎在材料暴露于鹽水時增加。這些結果表明，SSSR12能夠在醫療設備實際元件的預期使用時間展示出效力。要求開展進一步研究以了解通過較長時期暴露以及在不同環境條件下的抗菌性能水平。 通過將抗菌劑集成于設備元件內部或涂層設備而采用抗菌素處理醫療設備，已經證實可以幫助降低與設備相關的感染，但是只是少數情況。存在使用可以展現出生物相容性要求水平和持續效力水平的現有成份開發新的抗菌劑或新技術的機會。由于存在這些要求，銀基抗菌素仍然是集成于醫療設備內部或表面的常見和可靠的抗菌劑。鄭州浩瑞橡塑制品有限公司咨詢電話：13783607679